如何快速高效進(jìn)行突變體檢測(cè)和鑒定是植物基因組編輯技術(shù)迅速發(fā)展面臨的重要問題之一。目前植物基因組編輯突變檢測(cè)方法主要包括PCR/RE、T7EI錯(cuò)配切割、臨界退火溫度PCR (ACT-PCR)、Sanger測(cè)序和二代測(cè)序(NGS)等。以上所有的檢測(cè)方法都基于PCR反應(yīng)，且都有各自的不足之處。PCR/RE方法的需要設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的靶位點(diǎn)；T7EI無(wú)法區(qū)分純合突變體和野生型以及雜合突變體與雙等位突變體；ACT-PCR對(duì)PCR反應(yīng)條件要求極高，而且無(wú)法檢測(cè)到雜合突變；Sanger測(cè)序和NGS的價(jià)格比較昂貴，尤其是對(duì)于數(shù)目比較大的群體。

針對(duì)上述問題，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組利用CRISPR/Cas系統(tǒng)(包括Cas9和Cpf1)的體外切割特性，在六倍體小麥和二倍體水稻中建立了一種簡(jiǎn)單、高效、廉價(jià)的PCR/RNP植物突變體篩選策略。該方法不受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的限制，比PCR/RE具有更強(qiáng)的廣適性；比T7EI具有更高的準(zhǔn)確度；比Sanger測(cè)序更廉價(jià)，而且靈敏度更高。基于SpCas9和FnCpf1 RNPs的PCR/RNP方法可以用于檢測(cè)基因組編輯中經(jīng)NHEJ修復(fù)產(chǎn)生的所有indel突變；基于FnCpf1 RNPs的PCR/RNP方法可以用于檢測(cè)位于種子區(qū)域(seed region)內(nèi)的SNP突變。該方法尤其適用于小麥的瞬時(shí)表達(dá)基因組編輯體系，如該實(shí)驗(yàn)室之前建立的CRISPR/Cas9 IVTs和RNPs介導(dǎo)的DNA-free基因組編輯體系。這是由于瞬時(shí)表達(dá)基因組編輯體系在后續(xù)組織培養(yǎng)過程中不使用任何的篩選標(biāo)記，在T0代會(huì)獲得較多的待篩選植株，而且PCR/RNP方法可以使用通用引物對(duì)發(fā)生在小麥A組、B組和D組各拷貝的突變進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，不會(huì)受靶位點(diǎn)周圍SNPs的影響。此外，PCR/RNP方法也可以用于檢測(cè)TALEN蛋白所誘導(dǎo)的突變。

該研究成果于5月3日在線發(fā)表于Plant Biotechnology Journal 雜志上(DOI: 10.1111/pbi.12938)。高彩霞研究組博士生梁振為該論文的第一作者。相關(guān)研究得到科技部、北京市科委、中科院以及國(guó)家自然基金委的資助。